62/2000 Schützen Sie die Gesundheit von Säuglingen und Kleinkindern! Wanyi Ionenchromatographie bestimmt sieben Arten von menschlicher Milch

Vorwort

Oligosaccharide aus Muttermilch (HMO) sind eine Gruppe von Oligosacchariden mit einem Polymerisationsgrad von höchstens 3, die in der Muttermilch natürlich vorhanden sind.sie sind der drittgrößte feste Bestandteil der MuttermilchSie regulieren die Darmflora, fördern insbesondere die Kolonisierung der Bifidobacteriaceae im Darm des Säuglings und erhalten gleichzeitig die Gesundheit des Darms.Unterstützung der Immun- und GehirnentwicklungSeit der Einführung der ersten HMO-verstärkten Säuglingsnahrung in den Vereinigten Staaten im Jahr 2015eine große Auswahl an Säuglingsnahrung, Milch und Milchprodukte, Nahrungsergänzungsmittel und funktionelle Lebensmittel, die HMO enthalten, wurden weltweit verkauft. Ab dem 1. Juni 2023 haben die USA und die EU sieben HMO für die Verwendung zugelassen:2'-Fucosyllactose, 3'-Fucosyllactose, Difcosyllactose, Lacto-N-Neotetraose, Lacto-N-Tetraose, 3'-Sialillactose und 6'-Sialillactose.

Unter den gängigen Methoden zur Detektion von HMO erfordert die Flüssigchromatographie vor der Detektion eine Derivatierungsreaktion, beinhaltet eine komplexe Probenvorbereitung und die Derivatierungsreagenzien sind oft giftig.die hitzelabile Natur von HMO führt auch zu geringer Reaktionsfähigkeit und schlechter Wiederholbarkeit in LC-MSIm Gegensatz dazu bietet die Ionenchromatographie mit amperometrischer Detektion von Kohlenhydraten eine einfache Probenvorbereitung, eine hohe Reaktionsfähigkeit und eine gute Wiederholgenauigkeit, was ihr klare Vorteile für die HMO-Analyse bietet.In dieser Anwendungsbemerkung wird manuell zubereitetes Natriumhydroxid verwendet., Natriumacetat und ultrarein Wasser als Eluents, und verwendet den WAYEAL IC6300-Ionenchromatographen zur Bestimmung von HMO in Säuglingsnahrungsmitteln.hohe Empfindlichkeit und gute Linearität, die eine nützliche Referenz für die Erkennung von HMO in Lebensmitteln bietet.

Schlüsselwörter: Ionenchromatograph; Oligosaccharide aus menschlicher Milch; Amperometerdetektor.

1- Instrumente, Ausrüstung und Reagenzien

1.1 Reagenzien und Normen

Tabelle 1. Liste der Reagenzien und Normen

1.2 Labormaterialien und Hilfsgeräte

• 1.2.1 Analysewaage (lesbarkeit 0,1 mg);
• 1.2.2 Thermostatswasserbad;
• 1.2.3 Zentrifuge;
• 1.2.4 Membranfilter aus wässrigem Polyethersulfon (0,45 μm);
• 1.2.5 Ultrareines Wasser;
• 1.2.6 Vakuumfiltervorrichtung;
• 1.2.7 Vorbehandlungskartuschen für RP-Festphasen-Extraktion (SPE);
• 1.2.8 Einwegspritzen (20 ml, 5 ml).

2. Versuchsmethode

2.1 Aufbereitung der Lösung

• 2.1.1 200 mmol/l Natriumhydroxidlösung: Pipette 10,5 ml mit 50% NaOH, mit Wasser auf 1000 ml verdünnt und unter Vakuum gefiltert.
• 2.1.2 Mischlösung aus 75 mmol/l NaOH und 250 mmol/l Natriumacetat: 20,51 g Natriumacetat genau wiegen, in Wasser auflösen und in einen 1000 ml großen Kolben überführen; genau Pipette 3.95 ml 50% NaOH, auf 1000 ml mit ultrareinem Wasser verdünnen und unter Vakuum filtern.
• 2.1.3 3% Sulfosalicylsäure Lösung: 3,0 g Sulfosalicylsäure abwiegen, in Wasser auflösen und auf 100 ml verdünnen (frisch zubereiten).
• 2.1.4 Gemischte Standard-Stammlösung: 5 mg 2'-Fukosyllactose, 3'-Fukosyllactose, 3'-Sialillactose, 6'-Sialillactose, Lacto-N-Tetraose und Lacto-N-Neotetraose jeweils genau abwägen (bis zur nächsten 0,001).1 mg), in einen 10 ml großen Kolben gelegt, in Wasser gelöst und bis zur Markierung verdünnt, um einen Mischbestand von 500 mg/l herzustellen.in einen 10 ml großen Kolben gelegt, auflösen und bis zur Markierung verdünnen, um einen Stoff von 100 mg/l herzustellen.
• 2.1.5 Gemischte Arbeitslösungen: Die gemischte Grundlösung wird genau durch Pipette geleitet (2.1.4) in Volumenkolben und mit Wasser verdünnt, um gemischte Arbeitslösungen aus 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT und DFL bei 0 zu erzeugen.5, 2, 4, 6, 8 und 10 mg/l. Vor der Anwendung frisch zubereiten.

2.2 Probenvorbereitung

Die Probe wird in einem kleinen Becher mit etwa 2,0 g gewogen, sorgfältig mit 50 ml warmem Wasser (ca. 50 °C) gemischt, 40 ml 3%ige Sulfosalicylsäure-Lösung zugesetzt,übertragen und auf 100 ml in einem Volumenkolben verdünnen, und 10 min lang sonisieren. Filtern Sie durch Filterpapier oder Zentrifuge (12.000 R/min, 15 min).die ersten 3 ml entsorgen und das Eluat zur Analyse sammelnVor Gebrauch wird die RP SPE-Patrone mit 20 ml Methanol, gefolgt von 15 ml Wasser, konditioniert und 30 Minuten lang ausgeglichen.

2.3 Versuchsbedingungen

2.3.1 Bedingungen der Ionenchromatographie

3. Ergebnisse

3.1 Lineare Reichweite

Es wurde eine angemessene Aliquota jeder gemischten Arbeitslösung analysiert, wobei der lineare Bereich 0,5-10 mg/l betrug.Die Abweichungen zwischen den gemessenen und den Nennkonzentrationen lagen innerhalb der maximal zulässigen Abweichung, waren die R2-Werte über 0.999Alle Komponenten zeigten eine gute Linearität.

Tabelle 2. Lineare Bereiche der Verbindungen

Abbildung 1. Überlagerte Kalibrierchromatogramme der sieben HMO-Standards

3.2 Probenprüfungsergebnisse

Die Proben 1 und 2 wurden nach zehnfacher Verdünnung untersucht, wobei der Gehalt jedes der sieben HMO wie folgt berechnet wurde: X ist der Gehalt in der Probe (mg/100g);c ist die Konzentration in der Probenlösung aus der Kalibrierkurve (mg/L)V ist das konstante Volumen (mL); m ist die Probenmasse (g); f ist der Verdünnungsfaktor.

Abbildung 2. Ionenchromatogramm der 10-fach verdünnten Probe 1

Abbildung 3. Ionenchromatogramm der 10-fach verdünnten Probe 2

Tabelle 3 Ergebnisse der Probenprüfung

3.3 Präzision

Die Arbeitslösung auf der vierten Kalibrierstufe wurde bei sechs aufeinanderfolgenden Injektionen unter den Bedingungen von 2 analysiert.3.1Die RSD der sieben HMO-Inhalte wurde zur Bewertung der Wiederholbarkeit berechnet.

3.3.1 Standardpräzision der Wiederholbarkeit

Testergebnisse:

Abbildung 4. Überlagerte Chromatogramme von unabhängigen Replikateinspritzungen des Kalibrierstandards S4

Tabelle 4. Wiederholbarkeitsgenauigkeit der Norm

3.4 Grenzen der Erkennung und der Quantifizierung

LOD: Aliquoten der Standardlösung wurden zu einer Mischlösung mit 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL und 160 μg/L 3'-SL verdünnt.20 parallele Proben wurden vorbereitet und analysiert..

LOQ: Aliquoten der Standardlösung wurden zu einer Mischlösung mit 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL und 500 μg/L 3'-SL verdünnt.Sechs parallele Proben wurden vorbereitet und analysiert..

Die Testergebnisse sind wie folgt:

Tabelle 5. S/N-Ergebnisse für LOD und LOQ der sieben HMO

3.5 Spezifität

In einen 10 ml großen Kolben wurden Aliquoten (100 μL je) von Glukose-, Fruktose-, Saccharose- und Maltose-Standardlösungen hinzugefügt und mit einer 67-fachen Verdünnung der Probenlösung 2 bis zur Markierung verdünnt.Die Lösung wurde analysiert, um zu überprüfen, ob diese Zucker die Spitzen der sieben HMO beeinträchtigt habenWie unten gezeigt, zeigten die vier Zucker keine signifikanten Beeinträchtigungen bei der Bestimmung der sieben HMO in Milchpulver.

Abbildung 5. Überlagerte Chromatogramme der Kalibrierung S6, Probe 2 und Probe 2 mit vier Zuckerstandards

4Schlussfolgerung.

Bei dieser Validierung wurde mit dem WAYEAL-Ionenchromatograph die Methode zur Bestimmung von HMO in Lebensmitteln überprüft.LNnT, LNT, 6'-SL und 3'-SL alle innerhalb von 60 min eluieren; die Empfindlichkeit entspricht den nationalen Normenanforderungen und die linearen Korrelationskoeffizienten sind alle größer als 0.999. Die Wiederholbarkeit sowohl der Normen als auch der Proben ist gut. Mit Ausnahme der beiden Sialyllaktosen liegen die LOD und LOQ auf dem Niveau von μg/L. Das Verfahren hat eine gute Spezifität, ohne dass Störstoffe gefunden werden,und erfüllt insgesamt die Standardanforderungen.