Bestimmung von Aflatoxin B1, einem Karzinogen der Gruppe 1, in öligehenden Pflanzen mit dem Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS-System

Aflatoxin B₁ist ein hochgiftiger Sekundärmetabolit, der hauptsächlich von produziert wird Aspergillus flavusund Aspergillus parasiticus. Innerhalb der Aflatoxin-Familie weist es die stärkste Toxizität und die weiteste Verbreitung auf. Es übt seine toxische Wirkung aus, indem es die intrazelluläre DNA- und RNA-Synthese hemmt und den Proteinstoffwechsel stört, mit einer gezielten schädigenden Wirkung auf die Leber.Im Vergleich zu anderen Mykotoxinen wie Ochratoxin und Patulin ist Aflatoxin B₁ist äußerst giftig und weist eine nachgewiesene krebserregende Wirkung auf. Es wurde als klassifiziert Karzinogen der Gruppe 1von der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Es wird häufig in ölhaltigen Pflanzen wie Erdnüssen, Mais, Nüssen und Pflanzenölen nachgewiesen und ist daher ein vorrangiger Kontaminant für die Lebensmittelsicherheitskontrolle weltweit.

Kontamination mit Aflatoxin B₁tritt typischerweise auf, wenn ölhaltige Pflanzen während des Pflanzens, der Ernte oder der Lagerung hohen Temperaturen und hoher Luftfeuchtigkeit ausgesetzt sind, was das Pilzwachstum fördert. Darüber hinaus ist Aflatoxin B aufgrund seiner stabilen chemischen Eigenschaften wirksam₁können durch herkömmliche Kochtemperaturen nicht zerstört werden, was zu immer wieder auftretenden Rückstandsproblemen in landwirtschaftlichen Produkten und verarbeiteten Lebensmitteln führt.

Die kurzfristige Einnahme einer hohen Dosis kann zu einer akuten Vergiftung mit Symptomen wie starken Bauchschmerzen, Erbrechen, Gelbsucht und Leberversagen führen, die in schweren Fällen tödlich sein können. Eine langfristige Exposition gegenüber niedrigen Dosen führt zu einer Anreicherung in der Leber, was zu chronischen Leberschäden wie Leberfibrose und Leberzirrhose führt und möglicherweise sogar primären Leberkrebs auslöst. Bevölkerungsgruppen mit geringerer Immunität, darunter Kinder, ältere Menschen und Personen mit bereits bestehenden Lebererkrankungen, haben ein höheres Risiko für Aflatoxin B₁Vergiftung.

In China legt der nationale Standard GB 2761-2017 (National Food Safety Standard – Maximum Levels of Mycotoxins in Foods) die maximalen Rückstandsgrenzwerte für Aflatoxin B fest₁in verschiedenen Arten von Lebensmitteln. Zusätzlich, GB 5009.22-2016 (National Food Safety Standard – Bestimmung der Aflatoxine B und G in Lebensmitteln)bietet offizielle Analysemethoden zur Bestimmung von Aflatoxin B₁.

In diesem Anwendungshinweis wird die Etablierung einer Isotopenverdünnungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC-MS/MS) zur Bestimmung von Aflatoxin B beschrieben₁unter Verwendung des Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS-Systems.

Schlüsselwörter:Dreifach-Quadrupol; Aflatoxin B₁; Isotopenverdünnungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie.

1. Instrumente und Reagenzien

1.1 Gerätekonfiguration

Tabelle 1 Gerätekonfigurationsliste

1.2 Reagenzien und Standards

Tabelle 2 Reagenzien und Standards

1.3 Experimentiermaterial und Hilfsmittel

Vortex-Mischer

Hochgeschwindigkeitszentrifuge

Analysenwaage

Zentrifuge

Verteiler für Festphasenextraktion (SPE) (mit Vakuumpumpe)

Stickstoffverdampfer

Shaker

2. Experimentelle Methode

2.1 Lösungsvorbereitung

2.1.1 5 mmol/L Ammoniumacetatlösung:0,39 g Ammoniumacetat abwiegen, in Wasser auflösen und auf 1000 ml verdünnen. Gut mischen.

2.1.1 Methanol-Acetonitril-Lösung:100 ml Acetonitril zu 100 ml Methanol hinzufügen und gut vermischen.

2.2 Probenvorbehandlung

2.2.1 Probenextraktion

Geben Sie das Weizenmehl durch ein 2-mm-Testsieb. Wiegen Sie 5 g der Probe (auf 0,01 g genau) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen ein. Addiere 100μL Arbeitslösung mit internem Isotopenstandard (100 ng/ml), durch Vortexen mischen und 30 Minuten stehen lassen. 20 ml Methanol-Wasser-Lösung (70+30, Vol./Vol.) hinzufügen, zum Mischen vortexen und 20 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler schütteln. 10 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand zur späteren Verwendung.

2.2.2 Probenreinigung

Übertragen Sie 4 ml des Überstands genau in einen Behälter, geben Sie 23 ml 1 % Triton X-100 in PBS hinzu und mischen Sie gut.

Nachdem die ursprüngliche Flüssigkeit in der Immunaffinitätssäule vollständig abgelaufen ist, übertragen Sie die obige Probenlösung in einen 50-ml-Spritzenzylinder. Passen Sie die Flussrate so an, dass die Probenlösung gleichmäßig mit einer Geschwindigkeit von 1–3 ml/min durch die Säule fließt. Nachdem die Probenlösung vollständig abgelaufen ist, geben Sie 2 × 10 ml Wasser in den Spritzenzylinder und waschen Sie die Immunaffinitätssäule mit einer gleichmäßigen Flussrate. Nachdem das Wasser abgelaufen ist, trocknen Sie die Säule mit einer Vakuumpumpe.

Trennen Sie das Vakuumsystem. Stellen Sie ein 10-ml-Reagenzglas mit Messskala unter die Immunaffinitätssäule, entfernen Sie den 50-ml-Spritzenzylinder und geben Sie 2 × 1 ml Methanol hinzu, um die Säule mit einer kontrollierten Flussrate von 1–3 ml/min zu eluieren. Trocknen Sie die Säule anschließend erneut mit einer Vakuumpumpe. Sammeln Sie das gesamte Eluat im Reagenzglas.Das Eluat unter einem Stickstoffstrom bei 50 °C vorsichtig bis nahezu zur Trockne eindampfen. 1 ml der anfänglichen mobilen Phase hinzufügen und 30 Sekunden lang vortexen, um den Rückstand aufzulösen. Filtern Sie durch einen 0,22-μm-Membranfilter und sammeln Sie das Filtrat zur anschließenden Injektion in einem Autosampler-Fläschchen.

2.3 Versuchsbedingungen

2.3.1 Flüssigkeitschromatographie-Methode

Spalte: C18, 1.7μm, 2.1×50 mm

Mobile Phase Phase: A: Methanol-Acetonitril-Lösung; Phase B: 5 mmol/L Ammoniumacetatlösung

Flussrate: 0,3 ml/min

Säulentemperatur: 40°C

Injektionsvolumen: 3 µL

2.3.2 Massenspektrometrie-Methode

Tabelle 3 Parameter der Massenspektrometrie von Verbindungen

Hinweis: Das Sternchen (*) gibt das quantitative Ion an.

3. Experimentergebnis

3.1 Standardchromatogramm

Die Bestimmung von Aflatoxin B₁und der isotopeninterne Standard 13C17-Aflatoxin B₁war innerhalb von 5 Minuten erledigt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, zeigten beide Analyten hervorragende Peakformen und zufriedenstellende Reaktionen und erfüllten damit die Anforderungen für die experimentelle Analyse.

Abb. 1 Chromatogramme von Aflatoxin B₁und der interne Isotopenstandard 13C17​-Aflatoxin B₁

3.2 Linearer Bereich

Ein geeignetes Volumen der Standard-Stammlösung und der Arbeitslösung mit gemischten Isotopen des internen Standards wurde genau übertragen und mit der anfänglichen mobilen Phase verdünnt, um eine Reihe von Standard-Arbeitslösungen mit Aflatoxin B herzustellen₁Konzentrationen von 50, 20, 10, 5, 2, 1 und 0,5 ng/ml. Jede Lösung enthielt den internen Isotopenstandard in einer Konzentration von 2 ng/ml. Mit diesen Standards wurde eine Kalibrierungskurve erstellt. Über den linearen Bereich von 0,5–50 ng/ml und nach Korrektur mit 13C 17-Aflatoxin B₁als interner Standard die Abweichungen zwischen gemessenem und nominellem Aflatoxin B₁Die Konzentrationen lagen innerhalb der maximal zulässigen Abweichung. Der Korrelationskoeffizient (R) war größer als 0,999, was auf eine ausgezeichnete Linearität hinweist.

Abb. 2 Standardkurve von Aflatoxin B₁

3.3 Wiederholbarkeit

Standardlösungen in drei Konzentrationen (1, 10 und 20 ng/ml) wurden sechsmal hintereinander injiziert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die relativen Standardabweichungen (RSDs) der Retentionszeiten und Probenmengen für Aflatoxin B₁bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen lagen alle innerhalb von 5 %, was den Anforderungen des Experiments entsprach.

Tabelle 4 Wiederholbarkeitstest für Aflatoxin B₁in niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen

3.4 Spike-Wiederherstellung

Aflatoxin B₁Der Probe wurde Standardlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 5 ng/ml zu erreichen. Die dotierte Probe wurde dann mittels LC-MS/MS analysiert. Das durchschnittliche Ergebnis aus sechs aufeinanderfolgenden Injektionen betrug 5,147 ng/ml, mit einem RSD von 1,954 %. Die berechnete Wiederfindungsrate betrug 102,94 %, was den Anforderungen des Experiments entspricht.

3.5 Leergutrückstände

Nach kontinuierlicher Injektion der 20 ng/ml-Standardlösung wurde anschließend eine Blindprobe injiziert, um die Verschleppung zu bewerten. Wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde in der Blindprobe keine Verschleppung festgestellt.

Abb. 3 Leerchromatogramm der Verbindung

3.6 Beispieltest

Aflatoxin B₁wurde in Probe A nicht nachgewiesen (Abb. 4).

Abb. 4 Chromatogramm von Aflatoxin B₁in Probe A

4. Fazit

In dieser Studie wurde eine Isotopenverdünnungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC-MS/MS) zur Bestimmung von Aflatoxin B verwendet₁wurde mit dem Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometriesystem Wayeal LCMS-TQ9200 ermittelt. Die erhaltenen Daten zeigen, dass alle chromatographischen Peaks gute Peakformen ohne Tailing aufweisen. Die Empfindlichkeit erfüllt die experimentellen Anforderungen und der Korrelationskoeffizient (R) ist größer als 0,999 und erfüllt die Linearitätskriterien. Die Wiederholbarkeit bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen liegt innerhalb von 5 %, und nach der Probeninjektion hoher Konzentrationen wird keine Systemverschleppung beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode, wenn sie mit dem Wayeal-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometriesystem ausgestattet ist, die Anforderungen für die routinemäßige qualitative und quantitative Analyse von Zielproben erfüllt.