Bestimmung von β-Agonisten-Rückständen in Schweinefleisch mittels Wayeal LCMS-TQ9200 Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-System

Dieses Experiment bezieht sich auf "GB 31658.22-2022 Nationaler Lebensmittelsicherheitsstandard — Bestimmung von β-Agonisten-Rückständen in tierischen Lebensmitteln durch Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie" und verwendet das Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometriesystem Wayeal LCMS-TQ9200, um den Gehalt an β-Agonisten in Schweinefleisch zu bestimmen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass der System-Eignungstest gut geformte Peaks und eine gute Linearität aufwies und somit die experimentellen Anforderungen erfüllte. Die Wiederholbarkeit der Retentionszeit für die β-Agonisten-Standard-Arbeitslösung lag unter 1 %, und die Wiederholbarkeit der Peakfläche lag unter 3 %, was auf eine gute Wiederholbarkeit hindeutet. Für die Empfindlichkeitstestlösung von β-Agonisten waren die Signal-Rausch-Verhältnisse der Hauptpeaks bei Konzentrationen von 0,2 ng/ml bzw. 0,5 ng/ml deutlich größer als 3 bzw. 10, was die experimentellen Anforderungen erfüllte.

Bei der Prüfung der Schweinefleischprobe wurden keine β-Agonisten nachgewiesen. Alle oben genannten Daten erfüllen die instrumentellen Anforderungen, die in der Standardmethode festgelegt sind..

Schlüsselwörter:Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie; β-Agonisten; Clenbuterol; Lebensmittelsicherheit.

1. Instrumente und Reagenzien

1.1 Konfigurationsliste des LCMS

Tabelle 1 Instrumentenkonfigurationsliste

1.2 Reagenzien und Standards

Tabelle 2 Liste der Reagenzien und Standards

1.3 Experimentelles Material und Hilfsausrüstung

Ultraschallreiniger

Vortex-Mischer

Wasserbad-Konstanttemperaturschüttler

Hochgeschwindigkeitszentrifuge

2. Experimentelle Methode

2.1 Probenvorbehandlung

2.1.1 Enzymatische Hydrolyse und Extraktion

Wiegen Sie 2 g der Probe (genau bis ±0,05 g) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen ein. Geben Sie 6 ml 0,2 mol/l Ammoniumacetat-Pufferlösung und 40 μl β-Glucuronidase/Arylsulfatase hinzu. Mischen Sie gründlich mit einem Vortex-Mischer und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 37 °C im Dunkeln mit Schütteln in einem Wasserbad. Abkühlen lassen auf Raumtemperatur zur weiteren Verwendung.

2.1.2 Extraktion, Reinigung und Konzentration

Nehmen Sie die vorbereitete Lösung, geben Sie 100 μl der 100 ng/ml internen Standard-Arbeitslösung hinzu, mischen Sie gründlich mit einem Vortex-Mischer und zentrifugieren Sie 8 Minuten lang bei 8000 U/min. Sammeln Sie den Überstand, geben Sie 5 ml 0,1 mol/l Perchlorsäurelösung hinzu, mischen Sie mit einem Vortex-Mischer und stellen Sie den pH-Wert mit Perchlorsäure auf 1,0 ± 0,2 ein. Nach dem Zentrifugieren bei 8000 U/min für 8 Minuten stellen Sie den pH-Wert des Überstands mit 10 mol/l Natriumhydroxidlösung auf 10 ± 0,5 ein. Geben Sie 15 ml Ethylacetat hinzu, schütteln Sie 5 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 5000 U/min. Sammeln Sie die obere organische Schicht. Geben Sie zu der verbleibenden wässrigen Schicht 10 ml tert-Butylmethylether hinzu, schütteln Sie 5 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 5000 U/min. Sammeln Sie die obere organische Schicht. Vereinigen Sie alle organischen Schichten und verdampfen Sie sie unter einem Stickstoffstrom bei 50 °C zur Trockne. Lösen Sie den Rückstand in 5 ml 2 %iger Ameisensäurelösung auf und stellen Sie ihn beiseite. Bereiten Sie eine Festphasenextraktionssäule mit gemischter Mode vor, indem Sie sie nacheinander mit 3 ml Methanol und 3 ml 2 %iger Ameisensäure aktivieren. Geben Sie die vorbereitete Lösung auf die Säule, spülen Sie sie nacheinander mit 3 ml 2 %iger Ameisensäure und 3 ml Methanol und trocknen Sie sie unter Vakuum. Eluieren Sie die Säule mit 3 ml 5 %iger ammoniakalischer Methanollösung. Verdampfen Sie das Eluat unter einem Stickstoffstrom bei 50 °C zur Trockne. Lösen Sie den Rückstand in 0,5 ml Methanol-0,1 %ige Ameisensäurelösung (10:90, v/v) wieder auf, mischen Sie gründlich und filtern Sie durch eine 0,22 μm Mikroporenmembran zur Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie.

2.2 Experimentelle Bedingungen

2.2.1 Flüssigkeitschromatographische Bedingungen

Chromatographiesäule: C18, 1,8 μm 2,1*100 mm

Mobile Phase: A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser; B: Methanol

Flussrate: 0,3 ml/min

Säulentemperatur: 40 °C

Injektionsvolumen: 3 μl

3. System-Eignungstest

Der System-Eignungstest zeigt, dass die Zielpeaks gut geformt sind und keine Störungen durch andere Verunreinigungsppeaks aufweisen, was die experimentellen Anforderungen erfüllt.

Abb. 1 Chromatogramm von sieben β-Agonisten-Tests (1 ng/ml)

3.2 Linearer Bereich

Unter Verwendung von β-Agonisten-Standardlösungen und unter Verwendung von Arbeitslösungen mittlerer Konzentration wurde eine Standardkurve schrittweise erstellt. Der lineare Bereich für die sieben β-Agonisten betrug 0,5–50 ng/ml, mit R² > 0,99, was auf eine gute lineare Beziehung hindeutet.

Tabelle 3 Tabelle der linearen Bereiche für β-Agonisten

Abb. 2 Standardkurven-Chromatogramm von sieben β-Agonisten

3.3 Nachweisgrenze (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ)

Bei dieser Methode werden die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) für β-Agonisten auf 0,2 ng/ml bzw. 0,5 ng/ml festgelegt. Für jede Verbindung in dieser Methode ist das Signal-Rausch-Verhältnis bei den angegebenen Konzentrationen für LOD und LOQ größer als 3 bzw. 10, was die experimentellen Empfindlichkeitsanforderungen erfüllt.

Tabelle 4 Entsprechende Signal-Rausch-Verhältnisse für LOD und LOQ jeder Verbindung

Abb. 3 Ionenchromatogramme von sieben β-Agonisten bei LOD- und LOQ-Konzentration

3.4 Präzisionstest

Es wurde eine Mischlösung von β-Agonisten-Standardsubstanzen in niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen entnommen und sechs Mal hintereinander injiziert, um die Abweichungen der Retentionszeit und der Peakfläche zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Alle β-Agonisten zeigten Retentionszeitabweichungen von weniger als 1 % und Peakflächenabweichungen von weniger als 3 %, was die experimentellen Anforderungen erfüllte.

Tabelle 5 Präzisionstest für jede Verbindung

Abb. 4 Präzisionstest-Chromatogramme von sieben β-Agonisten (6 Injektionen)

3.5 Probentest

Die auf dem Markt gekauften Schweinefleischproben wurden gemäß der erwähnten Vorbehandlungsmethode getestet, und es wurden keine β-Agonisten nachgewiesen. Es wurden keine chromatographischen Peaks bei den Retentionszeiten beobachtet, die den sieben β-Agonisten entsprechen, während die anderen Peaks die Matrixsignale nach der enzymatischen Hydrolyse darstellen.

Abb. 5 Chromatogramm des Schweinefleischprobentests

4. Schlussfolgerung

Diese Methode verwendet das Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometriesystem Wayeal LCMS-TQ9200 zur Bestimmung von β-Agonisten in Schweinefleisch. Die Daten zeigen, dass alle chromatographischen Peaks eine gute Form ohne Tailing aufweisen, die Empfindlichkeit den experimentellen Anforderungen entspricht, die linearen Korrelationskoeffizienten 0,99 übersteigen und die Präzision zufriedenstellend ist, mit Retentionszeitabweichungen von weniger als 1 % und Peakflächenabweichungen innerhalb von 3 % für sechs aufeinanderfolgende Injektionen jeder Verbindung. Bei den Schweinefleischprobentests wurden keine β-Agonisten nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode, die mit dem Wayeal LC-MS/MS-System ausgestattet ist, die routinemäßigen qualitativen und quantitativen Nachweisanforderungen für die Zielanalyten erfüllt.