Bestimmung von Amphenicol-Antibiotika-Rückständen in Hühnerfleisch mittels Wayeal LCMS-TQ9200

Schlüsselwörter:LCMS, Amphenicol, Lebensmittelsicherheit, Rückstände von Tierarzneimitteln.

1. Instrumente und Reagenzien

1.1 Konfigurationsliste des LCMS

Tabelle 1 Liste der Instrumentenkonfigurationen

1.3 Versuchsmaterialien und Hilfsgeräte

Ultraschallreiniger

Vortexmischer

Wasserbad Stickstoffverdampfer

Zentrifugen mit hoher Geschwindigkeit

2. Versuchsmethoden

2.1 Aufbereitung der Lösung

2.1.1 2% ammonierte Ethylacetatlösung: Nehmen Sie 4 ml Ammoniakwasser und verdünnen Sie es mit Ethylacetat auf 200 ml.

2.1.2 4% Natriumchloridlösung: Nehmen Sie 4 g Natriumchlorid, lösen Sie es in Wasser auf und verdünnen Sie es auf 100 ml.

2.1.3 4% Natriumchlorid gesättigte n-Hexanlösung: Eine geeignete Menge von 4% Natriumchloridlösung nehmen, ein Überschuss an n-Hexan hinzufügen, mischen und lassen die Schicht trennen.und nehmen Sie die obere n-Hexanschicht.

2.1.4 gemischte interne Standardarbeitslösung: Eine angemessene Menge der gemischten internen Standardarbeitslösung wird eingenommen.mit 20% Methanol verdünnt, um Chloramphenicol-D5 bei 10 ng/ml und anderen internen Standards (Florfenicol-D3) zu erhalten, Thiamphenicol-D3 und Florfenicol-Amin-D3) bei jeweils 50 ng/ml.

2.2 Vorbehandlung der Proben

2.2.1 Probenextraktion: 2 g Probe abwiegen (genau ± 0,01 g), 100 μl gemischte interne Standardarbeitslösung hinzufügen, 1 Minute lang wirbeln, 10 ml 2%ige ammonierte Ethylacetatlösung hinzufügen,Wirbel für 10 min, bei 8000 Rpm für 5 Minuten zentrifugieren und das Supernatant sammeln; dem Rückstand weitere 10 ml 2% ammonierte Ethylacetatlösung hinzufügen und das Extraktionsverfahren wiederholen.Kombinieren Sie die beiden Supernatanten, verdunsten bis zum Trocknen unter einem Stickstoffstrom bei 50°C und zur Verwendung aufbewahren.

2.2.2 Probenreinigung: dem Reinigungsrückstand 3 ml Natriumchloridlösung zu 4% hinzugefügt, der Wirbel zu lösen, anschließend 5 ml natriumchloridgesättigte N-Hexanlösung zu 4% hinzugefügt, Wirbel für 30 Sekunden,Zentrifuge bei 8000 U/min für 5 Minuten, und entsorgen die obere N-Hexanschicht. Wiederholen Sie das Entfettungsverfahren einmal. Fügen Sie 5 ml 2% ammonierte Ethylacetatlösung hinzu, wirbeln Sie 10 Minuten, zentriformieren Sie bei 8000 U/min 5 Minuten lang,und das Übernatant sammeln. dem Rückstand weitere 5 ml 2%ige ammonierte Ethylacetatlösung hinzufügen und das Extraktionsverfahren wiederholen.1 ml 20%ige Methanollösung hinzugefügt, Wirbel für 30s, filtern durch eine Membran, und warten auf instrumentelle Analyse.

2.3 Versuchsbedingungen

2.3.1 Flüssigchromatographische Bedingungen

Chromatographische Spalte: C18 1,7 μm 2,1 x 50 mm

Bewegliche Phase: A: Acetonitril; B: 2 mM Ammoniumformat in Wasser

Durchflussrate: 0,3 ml/min

Kolonnentemperatur: 40 °C

Injektionsvolumen: 5 μl

2.3.2 Massenspektrometriebedingungen

Tabelle 3 Parameter der Ionenquelle

3Das Ergebnis des Experiments.

3.1 Standardchromatogramm

Die Bestimmung von vier Amidantibiotika und deren internen Standards wurde innerhalb von 6 Minuten abgeschlossen.und jede Verbindung zeigte eine zufriedenstellende Reaktion, die den Versuchsanforderungen entsprechen.

Abbildung 1 Chromatogramm von 4 Amphenicol Antibiotika und interner Standard (Chloramphenicol 0,2 ng/ml, andere Antibiotika 1 ng/ml)

3.2 Lineare Reichweite

Eine angemessene Menge der mit Amidalkohol gemischten Standardlösung ist zu nehmen und schrittweise auf eine Reihe von Konzentrationen zu verdünnen, um eine Standardkurve herzustellen.Für die quantitative Analyse wurde die interne Standardmethode der Isotope verwendet.Der lineare Bereich betrug 0,2-10 ng/ml für Chloramphenicol und 1-50 ng/ml für Florfenicol-Amin, Thiamphenicol und Florfenicol.Die Abweichung zwischen den Ergebnissen der linearen Detektion und den bekannten Konzentrationen war geringer als die maximal zulässige Abweichung, mit R2-Werten zwischen 0,9958 und 0.9998, was auf eine ausgezeichnete Linearität aller Komponenten hinweist.

Tabelle 4 Lineare Bandbreite der Verbindungen

Abbildung 2 Daten der Kalibrierkurve der vier Verbindungen

3.3 LOD und LOQ

Der chinesische nationale Lebensmittelsicherheitsstandard GB 31658.20-2022 legt fest, dass für diese Methode die Nachweisgrenze (LOD) für Chloramphenicol 0,1 μg/kg und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) 0 beträgt.2 μg/kg; während für Thiamphenicol, Florfenicol und Florfenicol-Amin die LOD 0,5 μg/kg und die LOQ 1 μg/kg beträgt.Die Signal-Rausch-Verhältnisse für alle Zielverbindungen bei den angegebenen Konzentrationen der Detektionsgrenze (LOD) und der Quantifizierungsgrenze (LOQ) sind signifikant größer als 3 und 10, die den in der nationalen Norm festgelegten Empfindlichkeitsanforderungen entspricht.

Tabelle 5 Grenzwerte für Nachweis und Quantifizierung für jede Verbindung

Abbildung 3 Chromatogramme der Detektionsgrenzen und Quantifizierungsgrenzen für vier Verbindungen

3.4 Präzisionsprüfung

Nehmen Sie niedrige, mittlere und hohe Konzentrationen von Amphenicol-Standardmischungen und führen Sie sechs aufeinanderfolgende Injektionen durch, um die Abweichungen in der Retentionszeit und dem Spitzenbereich zu vergleichen.Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.Die Abweichungen der Retentionszeit aller Amphenicolverbindungen waren weniger als 1% und die Abweichungen der Spitzenfläche waren weniger als 5%.mit einer Genauigkeit von RSD ≤ 15% gemäß der nationalen Norm.

Tabelle 6 Präzisionsprüfung für jede Verbindung

Abbildung 4 Präzisionschromatogramme von vier Amid-Alkoholverbindungen

3.5 Matrix Spiking Recovery Test

Die Genauigkeit dieser Nachweismethode wurde anhand eines Spike-Recovery-Tests bewertet.die Vorbereitung von matrixspikten Proben bei hoherJede Konzentrationsstufe der Spik-Proben wurde sechsmal unabhängig voneinander analysiert.Die Rückgewinnungsrate wurde berechnet, indem die festgestellte Konzentration in der Matrix vor und nach der Zugabe verglichen wurdeDie Ergebnisse sind wie folgt dargestellt: In der Hühnermatrix lagen die Spike-Wiedergewinnungsraten aller Verbindungen zwischen 94,5% und 107,2%, mit einem CV innerhalb von 5%,Angabe, dass die Genauigkeit den Methodenanforderungen entspricht.

Tabelle 6 Rückgewinnungsraten von Verbindungen in der Spiked Chicken Matrix

3.6 Probenprüfung

Nach der Prüfung der Proben auf dem Gerät wurden die zufällig gekauften Hühnerbrustproben aus Supermärkten mit der oben genannten Probenvorbehandlungsmethode extrahiert und gereinigt.Keines der vier Amid-Antibiotika wurde nachgewiesen.

Abbildung 5 Chromatogramm von vier Amid-Alkoholverbindungen in Supermarkt-Hühnerbrustproben

4Schlussfolgerung.

Bei dieser Methode wird das Wayeal LCMS-TQ9200 Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-System zur Bestimmung von Amphenicol-Antibiotika in tierischen Lebensmitteln verwendet.die gleichzeitige Aufnahme von Verbindungen sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus ermöglichtDie Daten deuten darauf hin, daß die Methode gut geformte chromatographische Spitzen ohne Rückstand erzeugt und daß ihre Empfindlichkeit den nationalen Normen entspricht.Die linearen Koeffizienten sind alle größer als 0..99Die Abweichung der Retentionszeit für alle Verbindungen bei sechs aufeinanderfolgenden Injektionen liegt bei 1% und die Abweichung der Spitzenfläche liegt bei 5%, was eine gute Präzision zeigt.Die Erholungsraten in der Hühnermatrix liegen zwischen 94Es wurden zufällig gekaufte Hühnerbrustproben aus Supermärkten analysiert.und keines der vier Amphenicol-Antibiotika wurde nachgewiesenDies zeigt, daß die Methode, die mit Wayeals Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-System ausgestattet ist,erfüllt die Anforderungen für die routinemäßige qualitative und quantitative Nachweisung der Zielproben.