Bestimmung des Koffeingehalts in Getränken durch Flüssigchromatographie

Koffein ist ein natürlich vorkommendes Methylxanthin-Alkaloid, das in Rohstoffen wie Kaffeebohnen, Teeblättern und Kakaobohnen weit verbreitet ist. Es dient als wesentlicher funktioneller Zusatzstoff und charakteristischer Geschmacksstoff in kommerziell erhältlichen Getränken, darunter kohlensäurehaltige Getränke, Energydrinks, tee-basierte Getränke und Kaffeegetränke. Mäßiger Koffeinkonsum kann physiologische Wirkungen wie die Erfrischung des Geistes und die Linderung von Müdigkeit hervorrufen. Übermäßiger und langfristiger Konsum kann jedoch leicht zu unerwünschten Reaktionen führen, darunter Herzrasen, Schlaflosigkeit und nervöse Übererregbarkeit. Darüber hinaus haben empfindliche Bevölkerungsgruppen – wie schwangere Frauen, Kinder und Personen mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen – noch niedrigere Toleranzschwellen. Folglich haben Lebensmittelsicherheitsstandards in verschiedenen Ländern klare regulatorische Grenzwerte für den Koffeingehalt in Getränken festgelegt.

In China dient der nationale Lebensmittelsicherheitsstandard mit dem Titel „Bestimmung von Koffein in Getränken“ (GB 5009.139-2014) als gesetzliche Grundlage für die quantitative Bestimmung von Koffein in Getränkematrizes. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist aufgrund ihrer hervorragenden Auflösung, ihrer starken Fähigkeit, Matrixinterferenzen zu widerstehen, und ihrer hohen quantitativen Genauigkeit zur bevorzugten Methode für die Analyse von Proben mit komplexen Matrizes geworden, darunter verschiedene Mischgetränke, milchhaltige Getränke und Kräuterfunktionsgetränke. Dieses Experiment wurde gemäß der Hochleistungsflüssigkeitschromatographiemethode durchgeführt, die im nationalen Standard GB 5009.139-2014 spezifiziert ist. Dabei wurde ein Verfahren zur Probenvorbehandlung und zur flüssigchromatographischen Trennung/Detektion für Getränkeproben etabliert und die qualitative Identifizierung und quantitative Analyse von Koffein in verschiedenen Getränkearten durchgeführt.

Schlüsselwörter: Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; Koffein; Getränke; Gehaltsbestimmung.

1. Instrument und Reagenzien

1.1 Liste der Konfigurationen des Flüssigkeitschromatographiesystems

Tabelle 1. Liste der Instrumentenkonfigurationen

1.2 Liste der Reagenzien und Standards

Tabelle 2. Liste der Reagenzien und Standards

1.3 Experimentelle Materialien und Hilfsausrüstung

Ultraschallreiniger;

Vortex-Mischer;

0,45m mikroporöse wässrige Membran.

2. Experimentelle Methode

2.1 Herstellung von Standardlösungen

2.1.1 Koffein-Standard-Stammlösung (2,0 mg/ml): Genau 20 mg Koffein-Referenzstandard (auf 0,1 mg genau) in einen 10-ml-Messkolben einwiegen, lösen und mit Methanol auf das Volumen auffüllen. Bei 4 °C im Kühlschrank lagern. Die Haltbarkeit beträgt 6 Monate.Koffein 100 μg/ml2.1.3 Koffein-Standard-Arbeitslösungen für die Kalibrierkurve: Genau 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml und 10,0 ml der Koffein-Standard-Zwischenlösung (2.1.2) in separate 10-ml-Messkolben überführen und mit Wasser auf das Volumen auffüllen. Die resultierenden Konzentrationen dieser Standardreihe betragen 10,0 μg/ml, 20,0 μg/ml, 40,0 μg/ml, 100 μg/ml bzw. 200 μg/ml. Unmittelbar vor Gebrauch herstellen.

2.2 Probenvorbehandlung(a) Entgasung: Die Probe mit einem Ultraschallreiniger bei 40 °C 5 Minuten lang beschallen.Koffein 100 μg/ml2.2.2 Milchartige flüssige Kaffee- und Teegetränke

1 g der Probe (auf 0,001 g genau) einwiegen, in einen 10-ml-Messkolben überführen und mit Trichloressigsäurelösung auf das Volumen auffüllen (sicherstellen, dass der Koffeingehalt in der Probenlösung innerhalb des Bereichs der Kalibrierkurve liegt). Gründlich mischen und zur Proteinfällung stehen lassen. Den Überstand entnehmen und zur weiteren Analyse durch eine mikroporöse Membran filtern.2.3.1 Chromatographische BedingungenMobile Phase: Methanol/Wasser = 24/76 (v/v)Säulentemperatur: 25 °CInjektionsvolumen: 10 μL3.1 Blindprobe

Abb. 1. Chromatogramm der Blindlösung

3.2 Linearbereich

Abb. 2. Linearitätsergebnisse des Koffein-ReferenzstandardsKoffein 100 μg/mlAnalyt

Linearbereich (μg/ml)

Korrelationskoeffizient (R)

Koffein

10–200

1,00000

3.3 WiederholbarkeitAbb. 3. Wiederholbarkeits-Chromatogramme des Koffein-Referenzstandards (n = 6)Tabelle 4. Wiederholbarkeits-Chromatographieparameter für den Koffein-Referenzstandard (n = 6)Probenname

Retentionszeit (min)

Peakfläche (mAU·s)

1Koffein 100 μg/ml7,192

2842,304

22843,223

3

7,158

2846,331

4

7,167

2841,149

Mittelwert

7,174

2843,641

9016

1,471

18,572

0,938

0,821

338,236

3802,53494,99 %

n.a.94,99 %

n.a.

—

Theoretische Platten

Tailing-Faktor

Signal-Rausch-Verhältnis