Bestimmung von Erythromycin-Rückständen in Antibiotika-Fermentationsrückständen mit dem Wayeal LCMS-TQ9200 Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-System

Erythromycin ist ein Makrolid-Antibiotikum, das durch die Fermentation von Streptomyces erythreus hergestellt wird. Es übt seine antibakterielle Wirkung hauptsächlich durch die Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese aus. Die Erythromycin-Produktion basiert hauptsächlich auf der Biofermentationstechnologie, die Schritte wie Stammauswahl, Saatkultur, großtechnische Fermentation in Tanks, Extraktion und Reinigung umfasst. Nach der Fermentation wird Erythromycin mit organischen Lösungsmitteln (wie Butylacetat) extrahiert, gefolgt von der Reinigung durch Kristallisation oder Ionenaustauscherharz-Trennung, wodurch letztendlich klinische Salze (z. B. Erythromycinethylsuccinat) entstehen. Der Erythromycin-Produktionsprozess erzeugt jedoch eine erhebliche Menge an Myzelfallrückständen (Fermentationsrückstände), die Restantibiotika, mikrobielle Proteine und Stoffwechselnebenprodukte enthalten können. Werden diese Rückstände nicht ordnungsgemäß behandelt, können sie über die Umweltfreisetzung oder die Verwendung als Futtermittelzusatzstoffe in die ökologische Kette gelangen und zu vielfältigen Gefahren führen: Rest-Erythromycin kann die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzgenen in Böden und Gewässern fördern und das Gleichgewicht der mikrobiellen Gemeinschaft stören; durch die Nahrungskette verstärkt, kann es das Auftreten resistenter Bakterienstämme bei Tieren oder Menschen auslösen und die Wirksamkeit von Antibiotika untergraben; darüber hinaus kann die ungenutzte organische Substanz in den Rückständen Umweltverschmutzung verursachen. Daher ist eine strenge Regulierung der Myzelfallrückstände eine entscheidende Maßnahme zur Eindämmung der Umweltverschmutzung durch die Erythromycin-Produktion.

Dieses Experiment wurde unter Bezugnahme auf den Standard "T/PIAC 00003—2021 Group Standard of China Pharmaceutical Industry Association - Method for the determination of erythromycin in antibiotic residue, organic fertilizer base materials, crops, and environmental media" durchgeführt, wobei das Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-System Wayeal LCMS-TQ9200 zur Bestimmung des Erythromycingehalts in den Myzelfallrückständen verwendet wurde. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass der System-Eignungstest eine gute Peakform und eine gute Linearität aufwies und somit die experimentellen Anforderungen erfüllte.

1. Instrumente und Reagenzien

1.1 Konfigurationsliste des LCMS

Tabelle 1 Liste der Instrumentenkonfiguration

1.2 Reagenzien und Standards

Tabelle 2 Liste der Reagenzien und Standards

1.3 Experimentelles Material und Zusatzausrüstung

Ultraschallreiniger

Vortex-Mischer

Hochgeschwindigkeitszentrifuge

2. Experimentelle Methode

2.1 Probenvorbehandlung

Wiegen Sie 0,5 g der Probe (genau bis auf 0,001 g) in ein Reagenzglas mit Glasstopfen ein. Geben Sie 50 ml Acetonitril hinzu, vortexen Sie 1 Minute lang, um die Mischung zu homogenisieren, und führen Sie eine ultraschallgestützte Extraktion für 20 Minuten durch. Überführen Sie die Mischung dann in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 4000 U/min für 10 Minuten. Sammeln Sie eine geeignete Menge des Überstands und passieren Sie ihn durch eine 0,22 μm Filtermembran. Verwerfen Sie mindestens 1 ml des ersten Filtrats und überführen Sie das restliche Filtrat in ein bernsteinfarbenes LC-Fläschchen zur Analyse.

2.2 Experimentelle Bedingungen

2.2.1 Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie-Methode

Chromatographiesäule: C18 1,7 μm 2,1x50mm

Mobile Phase: A: Acetonitril, B: 0,1% Ameisensäure in Wasser

Flussrate: 0,3 ml/min

Säulentemperatur: 30℃

Injektionsvolumen: 2 μL

2.2.2 Bedingungen der Massenspektrometrie-Methode

Tabelle 3 Massenspektrometrie-Ionensource-Parameter

3. Experimentelles Ergebnis

3.1 System-Eignungstest

Die Ergebnisse des System-Eignungstests zeigten gut definierte Zielpeaks ohne Störungen durch Fremdpeaks, wodurch alle experimentellen Anforderungen erfüllt wurden.

Abb. 1 Chromatogramm der Erythromycin A Standard-Arbeitslösung (0,5 ng/ml)

3.2 Linearer Bereich

Die Kalibrierungskurve für Erythromycin A wurde durch serielle Verdünnung der Standardlösung unter Verwendung von Arbeitslösungen mittlerer Konzentration erstellt. Die Kurve zeigte eine ausgezeichnete Linearität über den Bereich von 0,5-500 ng/ml mit einem Korrelationskoeffizienten (R²) von mehr als 0,99.

Tabelle 4 Linearer Bereich von Erythromycin A

Abb. 2 Kalibrierungskurve für Erythromycin A

3.3 Nachweisgrenze (LOD) und Quantifizierungsgrenze (LOQ)

In dieser Methode wurden die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) für die Erythromycin A Standardlösung auf 0,2 ng/ml bzw. 0,5 ng/ml bestimmt. Die entsprechenden Signal-Rausch-Verhältnisse (S/N) betrugen 110,02 und 292,20 und übertrafen damit die Mindestanforderungen von 3 und 10 erheblich, wodurch die experimentellen Empfindlichkeitskriterien erfüllt wurden.

Abbildung 3. Extrahierte Ionenchromatogramme für die LOD und LOQ von Erythromycin A

3.4 Präzisionstest

Die Erythromycin A Lösung wurde siebenmal hintereinander injiziert, wobei die Ergebnisse in der Abbildung unten dargestellt sind. Die Retentionszeitabweichung für Erythromycin A betrug 0,19 %, und die Peakflächenabweichung betrug 0,96 %, beide liegen unter 5 % und erfüllen somit die experimentellen Anforderungen.

Abbildung 4. Präzisionschromatogramme der Erythromycin A Probe (7 Injektionen)

3.5 Probentest

Nach der oben genannten Vorbehandlungsmethode betrug die Zielpeakfläche in der Feststoffprobe 7,4E6. Berechnet mit der externen Standardmethode wurde der Erythromycin A Gehalt in der Probenlösung auf 400 ng/ml bestimmt.

Abb. 5 Chromatogramm des Erythromycin A Probentests

4. Schlussfolgerung

Diese Methode verwendet das Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-System Wayeal LCMS-TQ9200 zur Bestimmung des Erythromycin A Gehalts in Antibiotika-Fermentationsrückständen. Die Daten zeigen, dass die Methode eine ausgezeichnete Leistung aufweist: Alle chromatographischen Peaks weisen eine optimale Form ohne Tailing auf, und die Empfindlichkeit erfüllt die experimentellen Anforderungen. Der lineare Korrelationskoeffizient (R²) übersteigt 0,99. Die Retentionszeit- und Peakflächenabweichungen für alle Verbindungen über sieben aufeinanderfolgende Injektionen liegen innerhalb von 1 %, was auf eine hohe Präzision hindeutet. Die Probenchromatogramme zeigen keine Störungen durch Fremdpeaks, und der gemessene Probengehalt beträgt 400 ng/ml. Diese Methode, die mit dem Wayeal LC-MS/MS-System ausgestattet ist, erfüllt die Anforderungen für die routinemäßige qualitative und quantitative Analyse der Testproben.