Bestimmung von Methioninhydroxyanalogon in Futtermitteln mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie nach Wayeal

Methioninhydroxyanalogon (MHA) ist ein organisches Säureadditiv, das in der Futtermittelindustrie weit verbreitet als Ersatz für Methionin eingesetzt wird. MHA wird häufig in Futtermitteln für Geflügel (Masthähnchen und Legehennen), Schweine (Ferkel und Mastschweine), Wiederkäuer (Milchkühe und Rinder) und in der Aquakultur (Fische und Garnelen) verwendet. Als Ersatz für Methionin zeigt es signifikante Effekte bei der Reduzierung von Futterkosten, der Verbesserung des Darmmilieus von Tieren und der Stärkung der tierischen Immunität.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit UV-Detektion eignet sich aufgrund ihrer hervorragenden Trenneffizienz, starken Resistenz gegen Matrixinterferenzen, hohen Nachweisempfindlichkeit sowie stabilen und zuverlässigen quantitativen Ergebnissen gut für die Analyse verschiedener komplexer Futtermittelproben. Dieses Experiment wurde gemäß dem Standard „Bestimmung von Methioninhydroxyanalogon in Futtermitteln mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie“ (GB/T 19371-2025) durchgeführt. Ein Hochleistungsflüssigkeitschromatograph der Wayeal LC3400-Serie, ausgestattet mit einem UV-Detektor, wurde zur Validierung des Probenvorbereitungsverfahrens und des flüssigkeitschromatographischen Trenn- und Detektionssystems eingesetzt, was sowohl den qualitativen Nachweis als auch die präzise quantitative Analyse von Methioninhydroxyanalogon in verschiedenen Futtermittelarten ermöglichte.

Schlüsselwörter: Futtermittel; Methioninhydroxyanalogon; Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.

1. Geräte und Reagenzien

1.1 HPLC-Konfigurationsliste

Tabelle 1 Liste der Konfigurationen des Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems

1.2 Liste der Reagenzien und Referenzstandards

Tabelle 2 Liste der Reagenzien und Referenzstandards

1.3 Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie

Tabelle 3 Bedingungen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

1.4 Experimentelle Materialien und Hilfsgeräte

Ultraschallreiniger;

Vortex-Mischer;

Hochgeschwindigkeitszentrifuge;

Analysenwaage;

Schüttler.

2. Versuchsmethode

2.1 Zubereitung von Lösungen

2.1.1 Standardkurvenlösungen:

Wiegen Sie genau eine geeignete Menge des Methioninhydroxyanalogon-Referenzstandards ab und lösen Sie diese in 10% Acetonitril auf, um eine Reihe von Standardlösungen mit Massenkonzentrationen von 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0, 40,0 und 80,0μg/ml herzustellen. Überführen Sie jeweils 5 ml jeder Standardlösung genau in 15 ml verschließbare Reagenzgläser. Geben Sie genau 0,1 ml einer 50%igen Kaliumhydroxidlösung hinzu und vortexen Sie 15 Sekunden lang. Geben Sie dann genau 0,2 ml einer 50%igen Phosphorsäurelösung hinzu und vortexen Sie weitere 15 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 8000 U/min. Überführen Sie den Überstand vor der Analyse durch einen mikroporösen Membranfilter.

2.1.2 Testprobenlösungen:

Wiegen Sie 5 g Futtermittelprobe in einen Behälter, geben Sie 50 ml einer 10%igen Acetonitril-Lösung hinzu und mischen Sie 30 Sekunden lang. Stellen Sie den Behälter auf einen Schüttler und schütteln Sie 30 Minuten lang. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 8000 U/min und bewahren Sie den Überstand für die spätere Verwendung auf. Überführen Sie genau 5 ml des obigen Überstands in ein 15 ml verschließbares Reagenzglas. Geben Sie genau 0,1 ml einer 50%igen Kaliumhydroxidlösung hinzu und vortexen Sie 15 Sekunden lang. Geben Sie dann genau 0,2 ml einer 50%igen Phosphorsäurelösung hinzu und vortexen Sie weitere 15 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 8000 U/min. Überführen Sie den Überstand vor der Analyse durch einen mikroporösen Membranfilter. Bereiten Sie zwei parallele Testprobenlösungen vor.

2.1.3 Wiederfindungstestlösungen:

Überführen Sie genau 2,5 ml des Probenüberstands und 2,5 ml jeder Standardreihenlösung in ein 15 ml verschließbares Reagenzglas. Geben Sie genau 0,1 ml einer 50%igen Kaliumhydroxidlösung hinzu und vortexen Sie 15 Sekunden lang. Geben Sie dann genau 0,2 ml einer 50%igen Phosphorsäurelösung hinzu und vortexen Sie weitere 15 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 8000 U/min. Überführen Sie den Überstand vor der Analyse durch einen mikroporösen Membranfilter.

3. Versuchsergebnis

3.1 Linearität und Bereich

Tabelle 4 Standardkurven-Konzentrationstabelle

Abb. 1 Standardkurve von Methioninhydroxyanalogon

Hinweis: Geeignete Mengen der Methioninhydroxyanalogon-Referenzstandardlösung wurden entnommen und seriell auf eine Reihe von Konzentrationen verdünnt, um die Standardkurve zu erstellen. Der lineare Bereich betrug 0,5–80,0 μg/ml, und der Korrelationskoeffizient (R) betrug 0,99983, was auf eine ausgezeichnete Linearität für den Analyten hinweist.

3.2 Präzision

Abb. 2 Überlagerte Chromatogramme des Präzisionstests für den Referenzstandard (20,0 μg/ml)

Tabelle 5 Präzisionstestdaten für den Referenzstandard (20,0 μg/ml)

Hinweis: Der Referenzstandard von Methioninhydroxyanalogon (bei einer Konzentration von 20,0μg/ml) wurde 6 Mal hintereinander injiziert. Die Wiederholbarkeit (RSD) der Retentionszeit betrug 0,084 % und die der Peakfläche 0,391 %, was auf eine gute Gerätepräzision hinweist.

3.3 Wiederfindung

Abb. 3 Überlagerte Chromatogramme des Wiederfindungstests für Methioninhydroxyanalogon in Futtermitteln

Tabelle 6 Wiederfindungstestdaten für Methioninhydroxyanalogon in Futtermitteln

Hinweis: Die Probe wurde mit dem Referenzstandard bei einer Konzentration von 40,0μg/ml versetzt und gemäß dem oben beschriebenen Verfahren analysiert. Die erzielte Wiederfindung betrug 88,56 %, was auf eine gute Genauigkeit der Methode hinweist.

3.4 Nachweisgrenze (LOD)

Abb. 4 Chromatogramm des Methioninhydroxyanalogon-Standards (2,5μg/ml)

Tabelle 7 Testdaten für den Methioninhydroxyanalogon-Referenzstandard (2,5μg/ml)

Hinweis: Basierend auf den Testdaten des Methioninhydroxyanalogon-Referenzstandards bei 2,5 μg/ml, wie in der obigen Tabelle gezeigt, wurde die theoretische Nachweisgrenze (LOD) bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3 (S/N = 3) als 0,033 μg/ml berechnet.

3.5 Test einer Futtermittelprobe

Abb. 5 Chromatogramm einer Futtermittelprobe

Hinweis: Methioninhydroxyanalogon wurde in einer Futtermittelprobe bei einer Konzentration von 0,402μg/ml nachgewiesen.

4. Schlussfolgerung

Dieses Experiment wurde gemäß dem Standard „Bestimmung von Methioninhydroxyanalogon in Futtermitteln mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie“ (GB/T 19371-2025) unter Verwendung des Hochleistungsflüssigkeitschromatographen der Wayeal LC3400-Serie mit UV-Detektor durchgeführt. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass der Zielpeak eine gute Symmetrie und eine hohe theoretische Bodenzahl aufwies. Im Konzentrationsbereich von 0,5–80,0μg/ml lag der Korrelationskoeffizient (R) über 0,9998. Die RSD-Werte für die Retentionszeit und die Peakfläche des MHA-Referenzstandards (20,0μg/ml) betrugen 0,084 % bzw. 0,391 %, was auf eine ausgezeichnete Gerätepräzision hinweist. Die Wiederfindung von MHA in mit 40,0μg/ml versetzten Futtermittelproben betrug 88,56 %, was auf eine gute Methoden-Genauigkeit hinweist. Die theoretische Nachweisgrenze (LOD) für MHA wurde als 0,033μg/ml bestimmt. MHA wurde erfolgreich in einer Futtermittelprobe bei einer Konzentration von 0,402μg/ml nachgewiesen. Alle oben genannten Daten erfüllen die Anforderungen der Pharmakopöe-Methode für die Geräteperformance.