Bestimmung von Rhodamin B in Chilipulver mit dem WAYEAL LCMS-TQ9200 LCMS/MS-System

Rhodamin B (auch als Rosenrot B oder Basic Violet 10 bezeichnet) ist ein synthetischer basischer Fluoreszenzfarbstoff, der zur chemischen Klasse der Xanthine gehört. Diese Substanz selbst weist eine leuchtend rosenrote Farbe auf und ist in polaren Lösungsmitteln wie Wasser und Ethanol gut löslich. Ursprünglich wurde es in industriellen Bereichen wie Textilien, Druckereien und zur Fluoreszenzmarkierung weit verbreitet eingesetzt. Aufgrund seiner geringen Kosten und seiner starken Färbekraft haben einige skrupellose Händler es illegal zu Lebensmitteln zum Färben hinzugefügt, wie z. B. Chilipulver, Sichuan-Pfefferkörner, Fleischprodukte und Gewürze, was es zu einem wichtigen Schadstoff macht, der die Lebensmittelsicherheit gefährdet.
Rhodamin B ist für den menschlichen Körper eindeutig toxisch. Es kann über den Verdauungstrakt oder die Haut in den Körper gelangen und den normalen physiologischen Stoffwechsel stören. Darüber hinaus birgt es potenzielle karzinogene und mutagene Risiken. Daher wurde es von mehreren Ländern als nicht essbarer Stoff eingestuft, der in Lebensmitteln verboten ist. Es ist ein wichtiges Ziel der Lebensmittelsicherheitsüberwachung, und seine Nachweisrate bleibt in verschiedenen Gewürzen und verarbeiteten Lebensmitteln konstant hoch.

In diesem Anwendungshinweis wurde eine Methode der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Bestimmung von Rhodamin B in Lebensmitteln unter Verwendung des Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometriesystems WAYEAL LCMS-TQ9200 etabliert. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Extraktion, präzise Trennung und empfindliche Quantifizierung des Zielanalyten und eliminiert gleichzeitig effektiv Matrixinterferenzen aus Lebensmitteln. Sie bietet eine zuverlässige technische Unterstützung für die schnelle Überprüfung und genaue Quantifizierung von Rhodamin B in Lebensmitteln und erleichtert so eine effektive Überwachung der Lebensmittelsicherheit.

Schlüsselwörter: Lebensmittelsicherheit, Rhodamin B, LCMS/MS

1. Instrumente und Reagenzien

1.1 Instrumentenkonfiguration

Tabelle 1 Liste der Instrumentenkonfiguration

1.2 Liste der Reagenzien und Standards

Tabelle 2 Liste der Reagenzien und Standards

1.3 Experimentelles Material und Hilfsausrüstung

Vortex-Mischer

Hochgeschwindigkeitszentrifuge

Analysenwaage

Festphasenextraktions-(SPE)-Manifold (mit Vakuumpumpe)

Stickstoffverdampfer

Orbitalschüttler

2. Experimentelle Methode

2.1 Vorbereitung der Lösungen

2.1.1 0,1 % Ameisensäure in Wasser: 1 ml Ameisensäure in 500 ml Wasser überführen, gründlich mischen und mit Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml auffüllen.

2.1.2 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril: 1 ml Ameisensäure in 500 ml Acetonitril überführen, gründlich mischen und mit Acetonitril auf 1000 ml auffüllen.

2.1.3 50 % Methanol in Wasser: 500 ml Methanol genau in einen 1-L-Messkolben überführen und dann mit Wasser auf Volumen auffüllen.

2.1.4 50 % Methanol in Wasser mit 0,1 % Ameisensäure: 1 ml Ameisensäure in 500 ml 50 % Methanol in Wasser überführen, gründlich mischen und mit 50 % Methanol in Wasser auf 1000 ml auffüllen.

2.1.5 5 % Ammoniak in Methanol: 5 ml Ammoniaklösung in einen 100-ml-Messkolben überführen, mit Methanol auf Volumen auffüllen und gründlich mischen.

2.2 Probenvorbehandlung

2.2.1 Probenextraktion

1 g Chilipulverprobe genau in ein 50-ml-Kunststoff-Zentrifugenröhrchen einwiegen. Genau 10,0 ml einer 50 %igen Methanol-Wasser-Lösung mit 0,1 % Ameisensäure zugeben und gut mischen. Zwei Keramik-Homogenisatoren zugeben, dann 15 Minuten auf einem Vortex-Mischer vortexen. 10 Minuten bei 8000 U/min zentrifugieren. 3 ml des Überstands (Extraktionsschicht) überführen und durch eine 0,45 μm organische Filtermembran filtern, bevor die Reinigung erfolgt.

2.2.2 Probenreinigung

Konditionierung der NovaPre MCX Festphasenextraktions-(SPE)-Kartusche: Vor Gebrauch die Kartusche sequenziell mit 3 ml Methanol und 3 ml Wasser aktivieren.

Genau 1,0 ml des Extrakts auf die NovaPre MCX Festphasenextraktions-(SPE)-Kartusche übertragen. Die Kartusche sequenziell mit 3 ml 0,1 % Ameisensäure in Wasser, 3 ml Wasser und 3 ml Methanol waschen. Den Zielanalyten mit 6 ml Ammoniak in Methanol-Lösung eluieren und das Eluat auffangen. Das Eluat unter einem Stickstoffstrom bei 45 °C bis fast zur Trockenheit verdampfen. Den Rückstand in 0,5 ml der mobilen Startphase lösen, durch eine 0,22 μm organische Filtermembran filtern und dann das Filtrat zur instrumentellen Analyse injizieren.

2.3 Versuchsbedingungen

2.3.1 HPLC-Bedingungen

Chromatographische Säule: C18, 1,7 μm, 2,1*50 mm;
Mobile Phase: Phase A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser; Phase B: 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril;
Flussrate: 0,4 ml/min;
Säulentemperatur: 40 °C;
Injektionsvolumen: 1 μl.

2.3.2 Massenspektrometrie-Bedingungen

Tabelle 3 Massenspektrometrie-Parameter für Verbindungen

Hinweis: * Quantifizierendes Ion.

3. Versuchsergebnis

3.1 Standard-Chromatogramm

Die Detektion von Rhodamin B erfolgte innerhalb von 7 Minuten. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wies der Peak der Verbindung eine gute Peakform und eine zufriedenstellende Reaktion auf, was den Anforderungen für die experimentelle Bestimmung entsprach.

Abb. 1 Chromatogramm von Rhodamin B

3.2 Linearer Bereich

Eine geeignete Menge der Rhodamin B Standard-Arbeitslösung wurde genau übertragen und mit der mobilen Startphase verdünnt, um die Standardkurve zu erstellen. Der lineare Bereich lag bei 0,1–10 ng/ml. Die Abweichung zwischen den linearen Ergebnissen und den bekannten Konzentrationen lag innerhalb der maximal zulässigen Abweichung. Der Bestimmtheitskoeffizient (R²) lag über 0,999, was eine gute Linearität anzeigt.

Abb. 2 Rhodamin B Standardkurve

3.3 Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze

In dieser Methode wurden die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) für Rhodamin B bei 0,1 ng/ml bzw. 0,5 ng/ml festgelegt. Die entsprechenden Signal-Rausch-Verhältnisse (S/N) sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Die S/N-Verhältnisse bei der LOD überschritten 3, während die bei der LOQ 10 überschritten.

Tabelle 4 Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze

Abb. 3 Signal-Rausch-Verhältnis bei LOD für Rhodamin B (0,1 ng/ml)

Abb. 4 Signal-Rausch-Verhältnis bei LOQ für Rhodamin B (0,5 ng/ml)

3.4 Wiederholbarkeit

Standardlösungen bei drei Konzentrationen (0,5, 2 und 5 ng/ml) wurden sechsmal hintereinander injiziert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die relativen Standardabweichungen (RSDs) der Retentionszeit und der Peakfläche für Rhodamin B bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen lagen alle innerhalb von 5 %, was den experimentellen Anforderungen entsprach.

Tabelle 5. Wiederholbarkeitsprüfung für Rhodamin B bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen

Abb. 5 Chromatogramme von 6 aufeinanderfolgenden Injektionen von 0,5 ng/ml Rhodamin B

Abb. 6 Chromatogramme von 6 aufeinanderfolgenden Injektionen von 2 ng/ml Rhodamin B

Abb. 7 Chromatogramme von 6 aufeinanderfolgenden Injektionen von 5 ng/ml Rhodamin B

3.5 Spike-Wiederfindung

Probe A wurde mit einer Standardlösung gespikt, um die Rhodamin B-Konzentration um 2 ng/ml zu erhöhen. Anschließend wurden sechs Replikatinjektionen analysiert. Die erhaltene Wiederfindung betrug 105,7 % mit einer RSD von 1,473 %, was die Akzeptanzkriterien der Methode erfüllte.

3.6 Carryover

Nach der Injektion der 10 ng/ml Standardlösung wurde ein Blindlösungsmittel injiziert, um den Carryover zu bewerten. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt. Der Carryover in der Blindprobe lag unter 10 % des niedrigsten Kalibrierstandards (0,1 ng/ml) und erfüllte die experimentellen Anforderungen.

Abb. 8 Blind-Chromatogramm der Verbindung

3.7 Probenprüfung

Die Rhodamin B-Konzentration in Probe A lag unterhalb der Nachweisgrenze der Methode (MDL).

Abb. 9 Chromatogramm von Rhodamin B in Probe A

4. Schlussfolgerung

In dieser Studie wurde eine Methode der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Bestimmung von Rhodamin B mit dem WAYEAL LCMS-TQ9200-System etabliert. Die erhaltenen Daten zeigten, dass die Methode chromatographische Peaks mit guter Symmetrie und ohne Tailing erzeugte und die Empfindlichkeit die experimentellen Anforderungen erfüllte. Der Bestimmtheitskoeffizient (R²) lag über 0,999 und erfüllte die Kriterien für die Linearität. Die Wiederholbarkeit (RSD) bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen lag innerhalb von 5 %, und der Carryover in der Blindprobe lag unter 10 % des niedrigsten Kalibrierstandards. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode in Verbindung mit dem WAYEAL LC-MS/MS-System in der Lage ist, die routinemäßigen qualitativen und quantitativen Nachweisanforderungen für Zielanalyten zu erfüllen.