Bestimmung von Spectinomycin mittels Wayeal Hochleistungsflüssigkeitschromatograph mit ELSD-Detektor

Der Evaporative Light-Scattering Detector (ELSD) ist ein neuartiger Massendetektor mit theoretischer Anwendbarkeit für jede Verbindung, die gasförmige Partikel bilden kann. Die Ausgabe 2025 der Pharmakopöe schreibt die Verwendung der Evaporative Light-Scattering Detection (ELSD) für die Analyse und Qualitätskontrolle von über 100 Arzneimittelvarianten vor. In der Praxis wird ELSD häufiger auf Verbindungen angewendet, denen die UV-Absorption (Ultraviolett) fehlt, wie z. B. Astragalosid, Kohlenhydrate, Aminoglykoside und Cholesterin, und dient oft als ergänzende Nachweismethode zu UV- und Fluoreszenzdetektoren. Die ELSD-Ergebnisse werden jedoch von mehreren Faktoren beeinflusst, darunter die Zusammensetzung der mobilen Phase, die Konzentration des organischen Lösungsmittels, der Elutionsmodus und die Zerstäubungsbedingungen. Um genaue und konsistente Analyseergebnisse zu gewährleisten, ist es daher unerlässlich, die Auswirkungen dieser Faktoren auf die Ergebnisse zu bewerten.
Diese Studie, die sich auf die Analysemethode für Spectinomycinhydrochlorid aus Teil II der Pharmakopöe 2025 bezieht und sich an den ICH-QbD-Prinzipien orientiert, verwendete ein orthogonales experimentelles Design, um die Analysebedingungen zu screenen und zu optimieren.

Abb. 1 Spectinomycinhydrochlorid

2. Instrument und Methode

In dieser Studie wurde die chromatographische Analyse mit dem HPLC-System der Wayeal’s LC3200-Serie durchgeführt. Die Instrumentenkonfiguration umfasste eine quaternäre Gradientenpumpe, einen Autosampler, einen Säulenraum und einen Evaporative Light-Scattering Detector. Die Systemsteuerung und die Datenerfassung/-verarbeitung wurden mit der SmartLab 2.0-Chromatographie-Software durchgeführt.

Tabelle 1 HPLC-Bedingungen

3. Lösungsvorbereitung

Probenlösung: Die Stammlösung von Spectinomycinhydrochlorid wurde vom Kunden mit einer deklarierten Konzentration von 10 mg/ml und einer Reinheit von 99,8 % bereitgestellt.

0,1 M Trifluoressigsäure-wässrige Lösung：Geben Sie präzise 6,8 ml Trifluoressigsäure in einen 1000 ml Messkolben. Verdünnen Sie bis zur Marke mit gereinigtem Wasser und mischen Sie gut. Filtern Sie die Lösung abschließend vor der Verwendung durch einen 0,45 μm Zellulosemembranfilter.

Standardlösungen: Die Stammlösung wurde mit gereinigtem Wasser verdünnt, um Probenlösungen mit Konzentrationen von 0,15, 0,25, 0,35, 0,50 bzw. 0,70 mg/ml herzustellen. Jede Lösung wurde dann vor der Verwendung durch einen 0,45 μm Zellulosemembranfilter filtriert.

4. Ergebnis und Diskussion

Die chinesische Pharmakopöe verwendet identische chromatographische Bedingungen für die Analyse verwandter Substanzen und des Hauptbestandteils unter dem Eintrag Spectinomycinhydrochlorid. Die Methode besagt, dass "der Detektor je nach den tatsächlichen Umständen konfiguriert werden kann". Bei der Studie wurde unter Berücksichtigung der instrumentellen Eigenschaften des ELSD3260, der Anforderungen der Analysemethode und relevanter Literatur ein Plackett-Burman-Experimentdesign verwendet, um mehrere experimentelle Parameter zu screenen (Tabellen 2 und 3). Anschließend wurde ein Box-Behnken-Design (Tabelle 4) verwendet, um die Peakflächenantwort des ELSD-Detektors zu optimieren.

Tabelle 2 Plackett-Burman-Experimentdesign

Tabelle 3 ANOVA-Analyse der Plackett-Burman-Experimentergebnisse

Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, zeigten die Gasflussrate, die Flussrate der mobilen Phase und die Post-Column-Kompensation negative Auswirkungen. Insbesondere konnte die Verringerung der Gasflussrate und der Flussrate der mobilen Phase zusammen mit der Deaktivierung der Post-Column-Kompensation die chromatographische Peakantwort erhöhen. Eine Verringerung der Flussrate der mobilen Phase kann jedoch zu einer erhöhten Peakverbreiterung und einer verringerten Nachweisempfindlichkeit führen. Daher wurde die Flussrate in Übereinstimmung mit der Standardmethode beibehalten. Während die Säulentemperatur und die Detektionstemperatur positive Auswirkungen zeigten, erhöhten sie den Antwortwert nicht signifikant. Folglich werden sich die nachfolgenden Studien auf die Optimierung der Gasflussrate, der Zerstäubertemperatur und der Verdampfertemperatur konzentrieren.

Die Auswirkungen von Gasflussrate, Zerstäubertemperatur und Verdampfertemperatur auf den Antwortwert wurden durch Anwendung eines Box-Behnken-Experimentdesigns innerhalb eines Response-Surface-Methodologie-Rahmens untersucht. Das Experimentdesign ist in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4 Box-Behnken-Experimentdesign

Die Nachweisbedingungen für Spectinomycinhydrochlorid wurden durch Simulation der Peakflächenvariation unter Verwendung der Response-Surface-Methodologie (Abbildung 2) und unter Berücksichtigung der instrumentellen Parameterbereiche ermittelt: Zerstäubertemperatur 85°C, Verdampfertemperatur 80°C, Detektortemperatur 50°C und Gasflussrate 0,2 SLM.

A. Einfluss von Gasflussrate und Verdampfertemperatur auf die Peakfläche

B. Einfluss von Gasflussrate und Zerstäubertemperatur auf die Peakfläche

C. Einfluss von Zerstäubertemperatur und Verdampfertemperatur auf die Peakfläche

Abb. 2 Variation der Peakfläche

Injektionspräzision

Die Stammlösung von Spectinomycinhydrochlorid wurde auf 0,35 mg/ml verdünnt, und sechs aufeinanderfolgende Injektionen wurden unter den angegebenen chromatographischen Bedingungen durchgeführt, wobei die Chromatogramme aufgezeichnet wurden. Die relativen Standardabweichungen (RSD%) der Retentionszeit und der Peakfläche für den chromatographischen Peak von Spectinomycinhydrochlorid wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5 Ergebnisse des Injektionspräzisionstests

Spezifität

Gemäß der ICH Q2(R2)-Richtlinie zur Validierung von Analyseverfahren und dem allgemeinen Kapitel der chinesischen Pharmakopöe 〈9101〉 Richtlinien zur Validierung von Analysemethoden wurde die optimierte Methode auf Spezifität, linearen Bereich, Genauigkeit und Wiederholbarkeit validiert.

Gereinigtes Wasser und die Probenlösung (0,35 mg/ml) wurden parallel analysiert, wobei die Chromatogramme aufgezeichnet wurden. Die Ergebnisse (Abbildung 3) zeigten keinen chromatographischen Peak bei der Retentionszeit von Spectinomycinhydrochlorid im Chromatogramm des gereinigten Wassers, während der Peak für Spectinomycinhydrochlorid in der Probenlösung eine Basistrennung von benachbarten Peaks erreichte (R > 1,5).

Abb. 3 Analyseergebnisse der Spectinomycinhydrochlorid-Probe (0,35 mg/ml)

Linearer Bereich

Bereiten Sie drei parallele Proben der Stammlösung von Spectinomycinhydrochlorid gemäß der Standardlösungsvorbereitungsmethode vor, analysieren Sie sie unter chromatographischen Bedingungen und zeichnen Sie die Chromatogramme auf. Führen Sie eine Regressionsanalyse unter Verwendung der chromatographischen Peakflächen und der entsprechenden Konzentrationen durch.

Abb. 4 Ergebnisse des Linearitätstests (logarithmisch transformiert vs. nicht transformiert)

Gemäß der Literatur ist die Beziehung zwischen dem ELSD-Antwortwert und der Konzentration nichtlinear, was eine logarithmische Transformation sowohl des Antwortwerts als auch der Konzentration vor der Durchführung der Regressionsanalyse erfordert [8,9,10]. Nach Anwendung der logarithmischen Transformation auf die experimentellen Daten überstieg der Korrelationskoeffizient der linearen Regressionskurve 0,999, was deutlich besser ist als das Ergebnis, das ohne logarithmische Transformation erzielt wurde (wie in Abbildung 4 gezeigt).

Genauigkeit und Wiederholbarkeit

Die Stammlösung von Spectinomycinhydrochlorid wurde auf Konzentrationen von 0,25, 0,35 und 0,50 mg/ml verdünnt. Für jede Konzentration wurden drei parallele Proben hergestellt, unter den angegebenen chromatographischen Bedingungen analysiert und die Chromatogramme aufgezeichnet. Der Gehalt wurde unter Verwendung der Regressionskurve berechnet, und die Wiederfindung und Wiederholbarkeit wurden bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6 Ergebnisse des Wiederfindungstests

Quantifizierungsgrenze (LOQ)

Verdünnen Sie die Streptomycinhydrochlorid-Stammlösung auf eine Konzentration von 12 μg/ml. Analysieren Sie die Probe unter chromatographischen Bedingungen und zeichnen Sie das Chromatogramm auf. Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) des chromatographischen Peaks von Streptomycinhydrochlorid und bestimmen Sie seine Wiederholbarkeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7 LOQ-Testergebnis

Die Ergebnisse zeigen, dass die relative Standardabweichung der Peakfläche für diese Konzentration der Spectinomycinhydrochlorid-Lösung unter der ICH-Richtlinienanforderung von S/N > 10 die Kriterien erfüllt. Daher kann sie als quantitative Grenzwertnorm für Spectinomycinhydrochlorid dienen.

5. Fazit

Basierend auf der Pharmakopöe-Methode wurde in dieser Studie ein zuverlässiges und robustes Analyseverfahren zur Quantifizierung von Spectinomycinhydrochlorid etabliert. Die Bedingungen des Evaporative Light-Scattering Detectors (ELSD) wurden systematisch optimiert. Die optimierte Methode zeigte eine verbesserte Stabilität und Genauigkeit, eine höhere Nachweisempfindlichkeit und einen zufriedenstellenden linearen Bereich.

Der ELSD3260-Detektor ist ein neu entwickeltes und entwickeltes Niedertemperatur-Split-Flow-Detektor. Er eignet sich für die Analyse sowohl nichtflüchtiger als auch halbflüchtiger Substanzen und bietet eine wertvolle Alternative für Verbindungen ohne UV-Absorption. In dieser Studie führten die Verwendung des ELSD3260 für die Analyse von Spectinomycinhydrochlorid zu ausgezeichneten Antwortwerten und Reproduzierbarkeit sowie zu einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Instrument gut für die quantitative Analyse von Spectinomycinhydrochlorid geeignet ist.